沈阳鸿元天合科技有限公司
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产品百科 Western Blot实验为什么要用内参?
  作为生物实验室常规的实验手段之一的WesternBlot(WB)几乎是每个生物学实验者都必须掌握的实验工具。WB实验结果既可以用来定性分析表达产物,也还可以指示目的蛋白量的变化趋势。对于很多实验者而言,顺利的时候Western Blot做起来很简单,可不顺的时候就会出现各种问题:没有条带、假阳性、多个条带、表达趋势不符合预期、内参配不平等等诸如此类。要解决问题的话要从抗体、样品制备、转印、电泳等各个环节入手去解决问题,往往令人心力憔悴。

  毕竟,作为一种有活性的生物大分子,抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确,而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物,确实是有一定的不确定性的。所以,严谨的WB实验设计中要求有良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时,借助参照体系很容易就可以查出问题所在,而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker、空白载体对照、已知量标准产物的正对照以及内参。

  内参是容易被忽略的一项。我们知道,要用WB比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多少,前提条件是等量的细胞上样,才有比较的基础。特别是表达量不高时,上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。内参即是内部参照(Internal Control),对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白,它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在WB实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。

  实验结果分析其实很简单:如果样品蛋白量有限,只够进行一次电泳转膜实验时,分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量,得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量,再用此数值进行样品间的比较和分析,得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分,可以先检测内参,观测样品间内参显色条带是否一致,根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验,至内参量一致为止;若内参一致,即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。

  常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin(被称为看家蛋白,HKP)。近期的国外文献报道中使用GAPDH内参的较多。GAPDH是参与糖酵解的一种关键酶,由4个 30~40 kDa的亚基组成,分子量 146 kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达,广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。一般的western实验都需要进行内参设置。具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除,得到每个样品目的蛋白的相对含量,然后才进行样品与样品之间的比较。

  但是以看家蛋白作为WB内参却存在着一些实际的问题:首先, 为了检测到低丰度目标蛋白需要大量上样,而看家蛋白多为高丰度蛋白,因此HKP 抗体产生的信号可能已经超出了检测的动态线性范围,不能反映上样量或其他参数的差异。也就是说,在HKP信号饱和的情况下是无法揭示目标蛋白表达量的真实变化关系;。其次, 在一些实验条件和体系下,HKP水平无法保持恒定,例如样本不同的处理条件和来源或在发育的不同阶段。解决这些实际问题有效的方法是以总蛋白为内参做归一化定量。目前越来越多的实验者开始使用总蛋白作为内参,得到更准确、稳定的结果,并提升数据的可信度。总蛋白比HKP的线性检测范围更宽(如图A所示),在整个实验和系统中更加稳定(如图B所示),因而能有效排除实验条件和体系对结果的影响,更真实地反映目标蛋白表达量的变化。
  图A.采用免染(Stain-Free)方法得到的总蛋白随上样量变化的曲线(蓝色),比传统HKP有更宽的动态线性范围,更能准确反映上样量的变化趋势。
  图B.采用总蛋白(Total protein staining)得到的蛋白上样量更为稳定,常用的看家蛋白(ACTB、TUBB、GAPDH)定量标准差都比较高。
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